1. مقدمه
در آزمایشگاه میکروبیولوژی گاهی لازم است که باکتری‌ها را زیر میکروسکوپ بررسی کنیم. مشاهده باکتری‌ها زیر میکروسکوپ اهداف مختلفی را به دنبال دارد که عبارت‌اند از: شناسایی، تشخیص، تعیین هویت، طبقه‌بندی، مشاهده شکل باکتری‌ها و نحوه قرارگرفتن آن‌ها کنار یکدیگر، پی‌بردن به‌اندازه باکتری‌ها و دیدن قسمت‌های مختلف آن‌ها.
مشاهده باکتری‌ها به‌طورکلی به دو صورت امکان‌پذیر است:
1) مشاهده به‌صورت زنده
2) مشاهده به‌صورت رنگ‌آمیزی شده
2. مشاهده میکروسکوپی باکتری‌ها به‌صورت زنده
در این روش ابتدا یک لام خشک و تمیز آماده کنید و روی آن یک قطره سرم فیزیولوژی استریل قرار دهید، سپس با یک آنس حلقوی استریل از کلنی باکتری یا سوسپانسیون میکروبی برداشته و به قطـره سرم فیزیولوژی منتقل کرده و آن را زیر میکروسکوپ مشاهده کنید .
مشاهده باکتری‌ها به‌صورت زنده معایبی دارد. ممکن است سبب گسترش و پخش باکتری در فضای آزمایشگاه شود. همچنین باکتری به‌صورت زنده تقریباً بی‌رنگ بوده و تضاد رنگی کافی با محیط مایعی که در آن معلق است، ندارد و در نتیجه به‌خوبی دیده نمی‌شود. به همین دلیل جهت مشاهده میکروسکوپی باکتری‌ها از تکنیک‌هایی مانند رنگ‌آمیزی استفاده می‌کنیم.
3. مشاهده میکروسکوپی باکتری‌ها به‌صورت رنگ‌آمیزی شده
به‌طورکلی تکنیک رنگ‌آمیزی سبب می‌شود که بین باکتری و محیط اطراف تضاد رنگی حاصـل شـده و باکتری بهتر دیده شود. در این روش، از رنگ‌های خاصی استفاده می‌شود که به اجزای مختلف باکتری‌ها رنگ می‌دهند. به‌عنوان‌مثال، از رنگ‌های اسیدی مانند ائوزین و یا رنگ‌های قلیایی مانند متیلن بلو استفاده می‌شود تا به طور مستقیم قابلیت تمیز بین اجزای باکتری‌ها، مثل دیواره سلولی، سیتوپلاسم، هسته و... را فراهم کند.
به‌طورکلی هر نوع رنگ‌آمیزی که بخواهیم انجام دهیم ابتـدا باید عـمـل گسترش (Smear) و بعد تثبیت(Fixation) را انجام دهیم. برای انجام عمل اسمير ابتـدا یک لام تميـز انتخاب نموده و یک قطره سرم فیزیولوژی استریل یا آب مقطر استریل روی لام قرار دهید، سپس با آنس حلقوی استریل یک کلنی از باکتری را برداشته و در کنار شعله در داخل این قطره حل کنید (برای استریل کردن آنس از شعله استفاده کنید به این صورت که؛ آنس را در زاویه ۴۵ درجه روی شعله نگه دارید تا کاملاً سرخ و قرمز شود سپس آن را به گوشه‌ای از سطح پلیت که کلنی وجود ندارد بزنید تا خنک شود، و پس از اتمام کار نیـز مـجـدداً آن را استریل کرده و بعد روی میز قرار دهید تا از انتقال آلودگی جلوگیری شود) و بعد قطره را در طول لام پخش کنید این عمل را اسمیر می‌گویند.
فیکس کردن نمونه با استفاده از روش‌های مختلفی انجام می‌شود :
۱) حرارت
در این روش لام را چند بار از روی شعله عبور داده به صورتی که قسمت تثبیت شده به سمت بالا باشد و مرتب با پشت‌دست لمس کنید، تا لام زیاد داغ نشود؛ زیرا داغ‌شدن زیاد باعث شکسته‌شدن لام می‌گردد و یا باکتری شکل واقعی خود را از دست می‌دهد. بعد از چنـد بـار عبور لام از روی شعله، گستره ما خشک می‌شود که این عمل را تثبیت می‌گویند .
۲) الکل
در این روش از الکل ۶۰ تا ۷۰ درصد استفاده می‌شود . چند قطره الکل روی نمونه قرار دهید پس از تبخیر الکل گستره تثبیت می‌شود.
۳) حرارت محیط
در این روش چون از حرارت استفاده نمی‌شود امکان تغییر شکل میکروارگانیسم وجود ندارد؛ اما کمی وقت‌گیر است؛ بنابراین معمولاً از این روش استفاده نمی‌شود.
3.1. انواع رنگ‌آمیزی
1) رنگ‌آمیزی ساده
2) رنگ‌آمیزی تفریقی
3) رنگ‌آمیزی ساختمانی
3.1.1. رنگ‌آمیزی ساده
هدف از رنگ‌آمیزی ساده مشاهده شکل باکتری می‌باشد. باکتری‌ها به اشکال مختلف گرد (کوکسی)، میله‌ای (باسیل)، خميـده (ويبريو) و مارپیچی (اسپریل) قابل‌مشاهده‌اند. شکل هر باکتری به درجه حرارت، سن باکتری و ترکیب محیط کشت بستگی دارد که بایـد شـكـل جـوان باکتری را در نظر گرفت. چنانچه باکتری‌های گرد به‌صورت تک‌تک قرار گیرند (کوکوس)، دوتایی (دیپلوکوک)، چهارتایی (تتراد)، خوشه‌ای (استافیلوکوک) و زنجیره‌ای (استرپتوکوک) نامیده می‌شوند. رنگ‌آمیزی ساده به دو صورت مثبت و منفی انجام می‌شود.
الف) رنگ‌آمیزی مثبت
در این نوع رنگ‌آمیزی از رنگ‌های قلیایی مانند متیلن بلو، فوشین و یا سافرانین استفاده می‌شود. در این روش رنگ جذب باکتری شده و محیط اطراف آن بی‌رنگ است.
مراحل:
1. تهیه اسمیر و تثبیت
2. ریختن چند قطره از رنگ موردنظر بر روی گستره یا اسمیر
3. شست‌وشو با آب مقطر پس از 5-3 دقیقه و سپس خشک‌کردن
4. مشاهده میکروسکوپی
ب) رنگ‌آمیزی منفی
در این روش از رنگ‌های اسیدی استفاده می‌شود و خود میکروارگانیسم رنگ نمی‌گیرد، بلکه زمینه لام رنگ می‌شود و باکتری‌ها در یک زمینه رنگ شده، به‌صورت شفاف دیده می‌شوند. در این روش عمل تهیه گستره و تثبیت آن با روش رنگ‌آمیزی مثبت متفاوت است، ابتدا یک قطره رنگ ائوزین (نیگروزین) در یک انتهای لام قرار دهید و نمونه را با آنس حلقوی برداشته و به قطره رنگ منتقل کنید (اگر از کلنی باکتری در محیط کشت جامد برمی‌دارید با آنـس حلقـوی، یک حلقه کامل آب مقطر به رنگ روی لام اضافه کنید و اگر از محیط کشت مایع نمونه‌گیری می‌کنید مستقیماً با آنس حلقوی، از محیط کشت مایع به‌عنوان نمونه وارد رنگ روی لام کنید) سپس با استفاده از لبه انتهایی لام دیگر مخلوط باکتری و رنگ را به‌صورت یک‌لایه نازک روی لام اول گسترش دهید و صبر کنید تا گستره با جریان هوا خشک شود و سپس زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.
3.1.2. رنگ‌آمیزی تفریقی
از این رنگ‌آمیزی برای تمایز گروه‌های مختلف باکتری‌ها از یکدیگر استفاده می‌شود . از جمله رنگ‌آمیزی‌های تفریقی می‌توان رنگ‌آمیزی گرم (Gram) و رنگ‌آمیزی اسیدفست(Acid fast) را نام برد.
الف) رنگ‌آمیزی گرم
با این روش می‌توان باکتری‌ها را به دو گروه گرم مثبت و گرم منفی تقسیم کرد. در متد رنگ‌آمیزی گرم باکتری‌های بنفش گرم مثبت گفته می‌شود و باکتری‌های قرمز گرم منفی گفته می‌شوند.
مراحل:
1) تهیه گستره و تثبیت
2) ریختن رنگ کریستال ویوله روی گستره و شست‌وشو پس از 1 دقیقه
3) ریختن لوگول روی گستره بدون انجام خشک‌کردن در مرحله قبل (جهت تثبیت رنگ قبلی) و شست‌وشو پس از 1 دقیقه
4) ریختن الکل روی گستره و شست‌وشو پس از 10 ثانیه
توجه! در این مرحله که به مرحله رنگ‌بری معروف است زمان بسیار مهم است. باکتری‌های گرم منفی در این مرحلـه بـه دلیـل تفـاوتی که در دیواره سلولی خود با باکتری‌های گرم مثبت دارند، بی‌رنگ می‌شوند و اگر زمان طولانی‌تر شود باکتری‌های گرم مثبت نیز بی‌رنگ می‌شوند و رنگ‌آمیزی به‌درستی انجام نمی‌شود.
5) ریختن سافرانین یا فوشین بر روی گستره و شست‌وشو پس از 30 ثانیه (در این مرحله باکتری‌های گرم منفی که در مرحله قبل بی‌رنگ شده بودند رنگ‌آمیزی می‌شوند).
6) خشک‌کردن و مشاهده میکروسکوپی
ب) رنگ‌آمیزی اسیدفست
به این نوع رنگ‌آمیزی، رنگ‌آمیزی Ziehl neelse گفته می‌شود . بعضی از باکتری‌ها مـاننـد مایکوباکتریوم‌ها و همچنین اکتینومیست‌ها به علت مقدار لیپید زیاد در دیواره سلولی‌شان رنگ‌های قلیایی را به‌راحتی نمی‌پذیرند؛ لذا در این باکتری‌ها یک‌رنگ قلیایی مثل فوشین را با حرارت به داخل باکتری نفوذ می‌دهند و وقتی باکتری رنگ را پذیرفت دیگر به‌راحتی از دست نمی‌دهد به این دلیل به اینها اسید فسـت می‌گویند. این رنگ‌آمیزی در درجه اول برای تشخیص بیماری‌هایی که به‌وسیله میکروب‌های اسید فست ایجاد می‌شود، مانند سـل و جـزام استفاده می‌شود. همچنین این روش به‌عنوان یک رنگ‌آمیزی تشخیصی در مورد تعدادی از میکروب‌های ساپروفیت و بی‌آزار اسید فست نیز به کار می‌رود.
مراحل:
1) تهیه گستره و تثبیت آن
2) ریختن رنگ فوشین روی گستره (با چراغ‌الکلی از زیر حرارت دهید به‌طوری‌که فقط بخار بلنـد شـود و نجوشد و در صورت تبخیرشدن رنگ می‌توانید مجدداً روی آن رنگ بریزید و به مدت ۵ دقیقه این کار را انجام دهید).
3) شست‌وشو پس از خنک‌شدن لام و ریختن اسیدسولفوریک 15 درصد (به علت بی‌رنگ شدن سایر ارگانیسم‌ها)
4) شست‌وشو مجدد و ریختن متیلن بلو روی گستره و مجدد شست‌وشو پس از 30 ثانیه
5) خشک‌کردن لام در مجاورت هوا و مشاهده میکروسکوپی
3.1.3. رنگ‌آمیزی ساختمانی
جهت مشاهده اجزاء باکتری مثل تاژک، کپسول، اسپور، دیواره سلولی و... رنگ‌آمیزی ساختمانی انجام می‌دهیم.
الف) رنگ‌آمیزی اسپور (اندوسپور)
برخی باکتری‌ها ایجاد اندوسپور می‌کنند. اندوسپور جسم بسیار مقاومی بوده و می‌تواند به مدت بسیار طولانی در محیطی که درجه حرارت بالا باشد یا مـواد شیمیایی نامساعد موجود باشد زنده بماند . بعضی از باکتری‌ها مانند باسیلوس و کلستریدیوم قابلیت تشکیل اسپور را دارند، درحالی‌که برخی دیگر این قابلیت را ندارند. به‌عنوان‌مثال باکتری‌های خانواده باسیلاسـه مانند باسيلوس سرئوس ایجاد اسپور می‌کنند . رنگ‌آمیزی اسپور به روش‌های مختلفی انجام می‌شود .در ادامه به بررسی این روش‌ها می‌پردازیم:
* روش ورتز (Verts)
مراحل:
1) تهیه اسمیر و تثبیت
2) ریختن مالاشیت گرین روی گستره (از آن جایی که اسپور رنگ را به‌راحتی نمی‌پذیرد؛ بنابراین آن را حرارت می‌دهیم تا باحرارت رنگ به داخل اسپور نفوذ کند. حرارت دادن طوری انجام شود که فقط بخار از آن بلند شود و رنگ نجوشد. در هنگام حرارت چون رنگ، بخار می‌شود باید مرتب رنگ اضافه شود تا سطح لام خشک نشود در غیر این صورت لام خواهد شکست. این کار در مدت ۱۰-۷ دقیقه صـورت می‌گیرد).
3) شستن لام و ریختن سافرانین روی گستره (30 ثانیه)
4) شستن رنگ‌های اضافی و خشک‌کردن
5) مشاهده میکروسکوپی با یک قطره روغن ایمرسيون و عدسی ۱۰۰
توجه! در این نوع رنگ‌آمیزی اسپور سبز و باکتری قرمز می‌شود.
* روش مولر (Muller)
مراحل:
1)تهیه گستره و تثبیت آن
2) ریختن فوشین غلیظ روی گستره و حرارت دادن به مدت 5 دقیقه (مانند روش قبل) و سپس شست‌وشو
3)اضافه‌کردن اتانول (با اضافه‌کردن اتانول رنگ لام از بین رفته و رنگ قرمز کم‌رنگی روی آن باقی می‌ماند که همان اسپورها هستند).
4) شست و شو و ریختن متیلن بلو (2-1 دقیقه)
5) شست‌وشو و خشک‌کردن در مجاورت هوا
6) مشاهده میکروسکوپی
توجه! در این روش میکروارگانیسم آبی و اسپور آن به رنگ قرمز دیده می‌شود.
* روش دورنر (Dorner)
در این روش از کربول فوشین گرم برای نفوذ به اسپور استفاده می‌شود و از نیگروزین به‌عنوان عامل بی‌رنگ‌کننده و همچنین به‌عنوان رنگ منفی گستره استفاده می‌شود .۵ قطره آب استریل در دو لوله‌آزمایش ریخته و در این دو لوله دو سوسپانسیون غلیظ از نمونه موردنظر (باسيلوس سرئوس و کلستریدیوم اسپروژنز) بسازید. به دو سوسپانسیون میکروبی به مقدار مساوی کربول فوشین اضافه کرده و لوله‌ها را به مدت ۱۰ دقیقه در حمام آب جوش حرارت دهید. سپس یک لام خشک و تمیز آماده کنید و یک قطره نیگروزین روی آن قرار داده و یک حلقه کـامـل بـا آنـس حلقوی از نمونه داخـل لوله، در قطره نیگـروزین حل کنید و پس از گذاشتن لامـل، زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.
توجه! در این روش اسپورها به رنگ قرمز و قسمت‌های جـوان سلول (سلول بدون اسپور) به‌صورت بی‌رنگ در یک زمینه تیره دیده می‌شوند.
ب) رنگ‌آمیزی کپسول باکتری
بسیاری از باکتری‌ها به‌وسیله یک‌لایه با ضخامت‌های مختلف احاطه شده‌اند که کپسول خوانده می‌شود. این لایه نسبت به سلول با شدت کمتری رنگ‌آمیزی می‌شود و غالبـاً به‌صورت یک محوطه رنگ نشده در اطراف سلول‌های رنگ شده ظاهر می‌شود. برای مشاهده کپسول روش‌های رنگ‌آمیزی خاصی وجود دارد:
* روش هیس (Hiss capsul staining)
در این روش ابتدا اسمیر را با سرم خون انسان یا خرگوش و یا اسب انجام دهید. بعـد از عمـل تثبیت به مدت یک دقیقه بر روی گستره کریستال ویوله بریزید و به ملایمی حرارت دهید. در انتها برای شستشو از محلول سولفات مس استفاده کنید. بعد از خشک‌کردن لام، نمونه را زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.
توجه! در این روش کپسول به‌صورت هاله کم‌رنگ در اطراف باکتری مشاهده می‌شود.
* روش استفاده از محلول تانن
بعد از انجام اسمیر و تثبیت، گستره را برای مدت ۳ دقیقه تحت‌تأثیر محلول تانن ۵ درصد قرار دهید سپس شستشو داده و رنگ‌آمیزی گرم انجام دهید و در انتها چند قطره ائوزین برای مدت ۴ دقیقه روی آن بریزید و سپس بشویید. پس از خشک‌کردن و در زیر میکروسکوپ نمونه را مشاهده کنید.
توجه! جسم باکتری قهوه‌ای تیره و کپسول قرمز می‌شود.
* روش دوگوئید (Duguid)
این روش که در واقع یک نوع رنگ‌آمیزی منفی است، با مرکب چین انجام می‌شود. بر روی یک لام خشک و تمیز یک قطره مرکب چین قرار دهید و از کلنی موردنظر روی آن قرار داده و مخلوط کنید. سپس با لبه لام دیگری که در زاویه ۴۵ درجه با افق روی لام اول قرار داده‌اید از آن گسترش تهیه کنید، و پس از خشک‌شدن آن را زیر میکروسکوپ بررسی کنید.
توجه! در این روش کپسول به‌صورت یک ناحیه رنگ نشده قابل‌مشاهده است.
* روش استفاده از سولفات مس 20 درصد
از نمونه موردنظر مثل پرگنه‌های کلبسیلا روی یک لام خشک و تمیز گستره تهیه کرده و آن را در هوای آزمایشگاه خشک کنید (از حرارت دادن لام برای تثبیت خودداری کنید). از محلول کریستال ویوله مقداری روی گستره ریخته و پس از ۲ دقیقه گستره را با محلول سولفات مس ۲۰ درصد شستشو داده و بگذارید در هوای آزمایشگاه خشک شود و سپس لام را زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.
توجه! در این روش سلول باکتری به رنگ آبی تیره و کپسول به رنگ آبی بنفش دیده می‌شود.
