ارزیابی ایمنی میکروارگانیسم های غذایی

1. مقدمه

بررسی ایمنی میکروارگانیسم‌های غذایی یک مسئله بسیار مهم تلقی میشود که توسط سازمان‌های حفاظت از سلامتی مانند سازمان بهداشت جهانی (WHO) و سازمان غذا و داروی ایالات متحده (FDA) و سازمان غذا و کشاورزی اروپا (EFSA) در سطح جهانی پیگیری می‌شود. میکروارگانیسم‌های غذایی به ویژه باکتری‌هایی که در مواد غذایی نقش مهم و مفیدی برعهده دارند، ممکن است باعث بروز بیماری در افرادی شوند که این مواد را مصرف می‌کنند. بنابراین، بررسی ایمنی میکروارگانیسم‌های غذایی اهمیت بسیاری دارد. برای ارزیابی ایمنی میکروارگانیسم‌های غذایی، از روش‌های مختلفی استفاده می‌شود که شامل آزمایشات مختلف برای شناسایی میکروارگانیسم‌ها، تعیین غلظت میکروارگانیسم‌ها و ارزیابی خطرات برای سلامتی افراد است. همچنین، سازمان‌های حفاظت از سلامتی نیز دستورالعمل‌هایی برای ایمنی مواد غذایی طراحی کرده‌اند که شرکت‌های تولید کننده باید به آنها عمل کنند تا اطمینان حاصل شود که مواد غذایی حاوی میکروارگانیسم‌های خطرناک به بازار عرضه نمی‌شوند.

2. تعریف Safety Assessment of Food Microorganisms

تعداد بسیار کمی از غذاهای سنتی که مصرف می‌شوند مورد ارزیابی سیستماتیک سم‌شناسی و تغذیه قرار گرفته‌اند، اما به دلیل سابقه طولانی و تهیه و استفاده مرسوم و عدم وجود شواهدی مبنی بر مضرات آن‌ها، عموماً برای خوردن بی‌خطر تلقی می‌شوند. این "تاریخچه استفاده ایمن" از غذاهای سنتی معیار ارزیابی نسبی ایمنی غذاهای جدید و غذاهای مشتق شده از موجودات اصلاح شده ژنتیکی را تشکیل می دهد.

Safety Assessment of Food Microorganisms به معنی ارزیابی ایمنی میکروارگانیسم‌های موجود در مواد غذایی است که هدف اصلی این ارزیابی، تضمین ایمنی مصرف کنندگان در مقابل بیماری‌های انتقالی به دست آمده از میکروارگانیسم‌های موجود در مواد غذایی است. برای ارزیابی ایمنی میکروارگانیسم‌های موجود در مواد غذایی، باید از روش‌های مختلفی استفاده شود. این شامل ارزیابی خطرهای بهداشتی، شناسایی و شناسایی تفصیلی میکروارگانیسم‌ها، تعیین آستانه‌های مجاز برای آن‌ها و ارزیابی تأثیر روش‌های پردازش غذایی بر روی این میکروارگانیسم‌ها می‌شود.

3. اهمیت ارزیابی ایمنی میکروارگانیسم های غذایی

میکروارگانیسم‌های موجود در مواد غذایی، در بیوتکنولوژی نقش مهمی را ایفا می‌کنند. برخی از این میکروارگانیسم‌ها می‌توانند برای تولید محصولات بیوتکنولوژیکی مانند آنزیم‌ها، پروتئین‌ها، ویتامین‌ها، اسیدهای آمینه و داروها استفاده شوند. در این راستا، ارزیابی ایمنی میکروارگانیسم‌های موجود در مواد غذایی بسیار مهم است، زیرا این میکروارگانیسم‌ها می‌توانند به عنوان منبع اصلی تولید محصولات بیوتکنولوژیکی در نظر گرفته شوند. همچنین، ارزیابی ایمنی میکروارگانیسم‌های موجود در مواد غذایی، بسیار مهم در تولید و استفاده از میکروارگانیسم های پروبیوتیک می باشد. پروبیوتیک ها، میکروارگانیسم هایی هستند که به عنوان مکمل غذایی به مواد غذایی اضافه می‌شوند و به بهبود وضعیت سلامتی دستگاه گوارشی و سیستم ایمنی بدن کمک می‌کنند. به همین دلیل، ارزیابی ایمنی میکروارگانیسم‌های موجود در مواد غذایی بسیار مهم است تا اطمینان حاصل شود که مصرف این مواد غذایی میکروبی، برای سلامتی افراد مضر نیست. ( جهت آشنایی با "متد های نوین میکروکپسولاسیون جهت حفظ پایداری پروبیوتیک ها" به این مقاله مراجعه فرمایید.)

به طور کلی، ارزیابی ایمنی میکروارگانیسم‌های موجود در مواد غذایی از اهمیت بسیاری در بیوتکنولوژی برخوردار است و به کمک آن می‌توان به تولید محصولات بیوتکنولوژیکی ایمن و اثربخش کمک کرد.

4. انواع میکروارگانیسم های موجود در مواد غذایی و خطرات احتمالی این میکروارگانیسم ها

از مهم ترین میکروارگانیسم های موجود در مواد غذایی میتوان به لاکتوباسیلوس ها، لاکتوکوکوس ها، پروپیونی باکتریوم ها، استرپتوکوکوس ها، بیفیدوباکتریوم ها، باسیلوس ها، پدیوکوکوس ها، ساکارومایسس ها، دباریومایسس ها و کاندیدا ها اشاره کرد. برخی از این میکروارگانیسم ها خاصیت پروبیوتیکی دارند و برخی در محصولات تخمیری و لبنی نقش بسیار مهمی دارند. در ادامه به بررسی برخی از خطرات احتمالی میکروارگانیسم هایی مانند لاکتوباسیلوس ها و باسیلوس ها می پردازیم.

4.1. لاکتوباسیلوس ها

لاکتوباسیل‌ها میکروارگانیسم‌هایی هستند که نقش مهمی در تولید غذاهای تخمیر شده مانند سبزیجات، گوشت ها و به ویژه محصولات لبنی تخمیر شده ایفا می کنند. همچنین به علت خواص پروبیوتیکی خود بسیار مورد توجه تولید کنندگان و مصرف کنندگان قرار گرفته اند. با این حال، موارد بسیار کمی از عفونت در افرادی که سیستم ایمنی ضعیفی دارند یافته گزارش شده است. این عفونت‌های فرصت‌طلب ممکن است با ویژگی‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی برخی از سویه‌های لاکتوباسیلوس پیچیده شوند. این دلیلی برای احتیاط است و انجام سنجش های حساسیت به آنتی بیوتیک را قبل از استفاده تکنولوژیکی و عملکردی توجیه می کند. بنابراین یک تجزیه و تحلیل ایمنی به روز از این لاکتوباسیل ها برای اطمینان از ایمنی مصرف کننده مورد نیاز است. همچنین لاکتوباسیلوس ها ممکن است سبب تولید آمین های بیوژنیک در محصولات تخمیری شوند و اثرات نامطلوبی ایجاد کنند. بحث مهم دیگر مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری های اسید لاکتیک مواد غذایی است که توجه زیادی را برانگیخته است. دهه ها استفاده از آنتی بیوتیک منجر به مقاومت باکتری ها در برابر بسیاری از آنتی بیوتیک های شناخته شده است. هر ساله در جهان باکتری های مقاوم به آنتی بیوتیک افراد زیادی را بیمار می کنند و بیشتر آنها در نتیجه مستقیم این عفونت ها جان خود را از دست می دهند. گونه‌های باکتری‌های اسید لاکتیک LABبه‌طور سنتی به‌عنوان کشت‌های آغازگر در تولید مواد غذایی تخمیر شده استفاده می‌شوند. LAB می تواند مقاومت آنتی بیوتیکی را از باکتری های دیگر در محیط طبیعی و مکانیسم های مختلف مقاوم از طریق جهش بدست آورد و این سویه های مقاوم ممکن است ژن های مرتبط را به گونه های بیماری زا منتقل کنند که ممکن است عواقب ویرانگری را به دنبال داشته باشد.مقاومت باکتری ها در برابر آنتی بیوتیک ها یک مشکل روزافزون بهداشت عمومی مهم در سراسر جهان است. بنابراین باکتری های اسید لاکتیک، از جمله لاکتوباسیل ها، ممکن است به عنوان مخزن ژن های مقاوم به آنتی بیوتیک عمل کنند. لاکتوباسیل‌هایی که به‌طور گسترده در کشت‌های آغازین یا به‌عنوان پروبیوتیک در محصولات لبنی استفاده می‌شوند، به تعداد زیادی وارد روده‌های ما می‌شوند و در آنجا با میکروبیوتای روده تعامل می‌کنند و خطر انتقال ژن ها به بسیاری از باکتری های اسید لاکتیک و سایر باکتری های بیماری زا را افزایش می دهند.

4.2. باسیلوس ها

باکتری های تشکیل دهنده هاگ، به ویژه چندین گونه باسیلاسه، به دلیل مقاومت در برابر دماهای بالا و پایداری در طول ساخت، ذخیره سازی و حمل و نقل، به طور فزاینده ای در مکمل های غذایی، غذا و نوشیدنی ها استفاده می شوند.

Bacillus subtilis یک باکتری گرم مثبت با سابقه طولانی استفاده در زیست شناسی مولکولی، صنعت، پزشکی و غذاهای تخمیر شده است. سویه‌های باسیلوس به‌ویژه به دلیل توانایی تولید و ترشح آنزیم‌ها به صورت توده و قابلیت دستکاری ژنتیکی مفید هستند. در دو دهه گذشته، بسیاری از سویه‌های Bacillus به عنوان پروبیوتیک های انسانی و میکروبی تغذیه مستقیم برای سلامت حیوانات استفاده شده است. گونه‌های باسیلاسه برای کاربردهای پروبیوتیکی مناسب هستند، زیرا می‌توانند در برابر شرایط اسیدی و نمک صفراوی بالا که در سراسر دستگاه گوارش انسان و حیوانات تک معده‌ای رخ می‌دهد، مقاومت می‌کنند. ارزیابی ایمنی هر سویه قبل از آزمایش بالینی و استفاده ایمن در مکمل های غذایی، غذا و نوشیدنی ضروری است. مهمتر از همه، چندین گونه باسیلوس، از جمله B. subtilis، B. mojavensis، B. pumilus و B. fusiformis می توانند سموم سیتوتوکسیک و استفراغی تولید کنند. 

5. روش‌های ارزیابی ایمنی میکروارگانیسم‌های غذایی

جهت ارزیابی ایمنی میکروارگانیسم های غذایی از روش های آزمایشگاهی مختلفی مانند روش‌های مولکولی( شامل استفاده از تکنیک‌های مولکولی مانند PCR و الکتروفورز ژل)، دستگاه ها و روش های آزمایشگاهی، پلتفرم ها و نرم افزارها استفاده می شود.

5.1. بررسی تولید سم با استفاده از BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

یکی از پرکاربردترین الگوریتم‌های جستجوی توالی‌های DNA و پروتئین است . BLASTN و BLASTX دو نسخه مختلف از این الگوریتم هستند:

BLASTN به عنوان نسخه DNA-based BLAST شناخته می‌شود. این نسخه برای جستجوی توالی‌های DNA در بانک‌های اطلاعاتی مختلف مانند GenBank و EMBL و همچنین برای مقایسه توالی‌های DNA میان دو یا چند توالی مورد استفاده قرار می‌گیرد .

BLASTX به عنوان نسخه protein-based BLAST شناخته می‌شود. این نسخه برای جستجوی توالی‌های پروتئینی در بانک‌های اطلاعاتی مختلف مانند Swiss-Prot و PDB و همچنین برای مقایسه توالی‌های پروتئینی میان دو یا چند توالی مورد استفاده قرار می‌گیرد. 

از BLAST می‌توان برای شناسایی میکروارگانیسم‌هایی که قادر به تولید سم هستند، استفاده کرد. اما باید توجه داشت که BLAST به تنهایی نمی‌تواند بگوید که آیا یک میکروارگانیسم خاص قادر به تولید سم است یا خیر. برای شناسایی میکروارگانیسم‌هایی که قادر به تولید سم هستند، باید ابتدا توالی ژنتیکی سم مورد نظر را شناسایی کرد و سپس با استفاده از BLAST، توالی ژنتیکی سم را با بانک‌های اطلاعاتی مختلف مقایسه کرد تا میکروارگانیسم‌هایی که دارای توالی ژنتیکی مشابه با توالی ژنتیکی سم هستند، شناسایی شوند.بنابراین، BLAST یکی از ابزارهای مفید برای شناسایی میکروارگانیسم‌هایی که قادر به تولید سم هستند، است، اما برای این کار نیاز است تا توالی ژنتیکی سم مورد نظر شناسایی شود و سپس با استفاده از BLAST، توالی ژنتیکی سم با بانک‌های اطلاعاتی مختلف مقایسه شود.

5.2. توالی یابی کل ژنوم با استفاده از PacBio RSII instrument و Illumina platform

PacBio RSII یک دستگاه سکانسینگ تک‌مولکولی (Single-Molecule Real-Time sequencing) از شرکت Pacific Biosciences است. این دستگاه به منظور توالی یابی DNA و RNA با دقت بالا و بدون نیاز به فراوری قبلی نمونه‌ها طراحی شده است. از دیگر ویژگی‌های دستگاه PacBio RSII می‌توان به سرعت بالای سکانسینگ، توالی یابی طول های بلند DNA و RNA، و قابلیت انجام تحلیل‌های پیچیده مانند شناسایی و تعیین موقعیت دقیق تغییرات ژنومی، اشاره کرد.

Illumina platform یکی از پرکاربردترین دستگاه‌های توالی یابی DNA و RNA است که توسط شرکت Illumina تولید می‌شود. این دستگاه جهت توالی یابی طول های کوتاه کاربرد دارد.

به طور کلی از این دو در زمینه‌های مختلفی از جمله ژنومیک، ترانسکریپتومیک، اپی‌ژنومیک، متابولومیک و همچنین تحلیل تنوع ژنتیکی استفاده می‌شود. با توجه به سرعت بالا و دقت بسیار بالا، این دستگاه به عنوان یکی از بهترین روش‌های سکانسینگ DNA و RNA در حال حاضر شناخته می‌شود.

5.3. تشخیص ژن مقاومت به آنتی بیوتیک با استفاده از ResFinder 3.2 software و روش disc diffusion test

ResFinder 3.2 :یک نرم‌افزار رایگان و مبتنی بر وب است که توسط مرکز ملی میکروبیولوژی سوئد توسعه داده شده است. نرم‌افزار ResFinder 3.2 به صورت آنلاین در دسترس است و برای استفاده نیازی به نصب نرم‌افزار در سیستم کامپیوتری نیست و این نرم افزار به منظور تشخیص ژن‌های مقاومت در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها در باکتری‌ها طراحی شده است. ResFinder 3.2 با استفاده از داده‌های سکانسینگ DNA، ژن‌های مقاومت در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها را در نمونه‌های باکتریایی تشخیص می‌دهد. این نرم‌افزار به کاربر اجازه می‌دهد تا با استفاده از داده‌های سکانسینگ DNA برای تشخیص نوع و تعداد ژن‌های مقاومت در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها در باکتری‌ها استفاده کند. 

disc diffusion test: یکی از روش های روتین و کاربردی در آزمایشگاه می باشد. در این روش دیسک های حاوی آنتی بیوتیک روی محیط کشت جامد قرار می گیرند. این دیسک ها هم اندازه بوده و با غلظت های مشخصی از آنتی بیوتیک آغشته شده اند.آنتی بیوتیک از دیسک به محیط اطراف منتشر شده و مانع از رشد نمونه میکروبی مورد نظر می شود. با اندازه گیری قطر هاله عدم رشد به سادگی می توان حساسیت باکتری را نسبت به آنتی بیوتیک ها تعیین نمود.

5.4. تشخیص توانایی تشکیل آمین های بیوژنیک توسط میکروارگانیسم مورد نظر

تشخیص با استفاده از روش PCR: در این روش، با استفاده از پرایمرهای خاصی که برای آمپلیفیکیشن قطعه‌های خاصی از ژن‌های مرتبط با تولید بیوژنیک طراحی شده‌اند، می‌توان ژن مرتبط با تولید امین بیوژنیک را در سویه باکتری شناسایی کرد. این روش به دلیل سرعت و دقت بالا، یکی از روش‌های مناسب برای تشخیص اسید لاکتیک امین بیوژنیک در باکتری‌ها است.

تشخیص با استفاده از روش پروتئومیک: در این روش، با استفاده از تجزیه و تحلیل پروتئوم‌های باکتری، می‌توان به دنبال پروتئین‌هایی بود که در فرآیند تولید امین بیوژنیک نقش دارند. سپس با استفاده از روش‌های تفسیر داده‌های پروتئومیک، این پروتئین‌ها شناسایی و تحلیل می‌شوند.

تشخیص با استفاده از اسید آمینه های پیش ساز: در این روش تلقیح میکروارگانیسم در محیط کشت های جامد و دارای شش اسید آمینه پیش ساز ال-آرژنین، ال-هیستیدین، ال-لیزین، ال-اورنیتین، ال-تریپتوفان و ال-تیروزین صورت میگیرد. سپس پلیت ها به مدت 96 ساعت به صورت بی هوازی در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه میشوند و تغییر رنگ در محیط جامد مشاهده میشود. در واقع ظهور رنگ بنفش در محیط نشان می دهد که آمین بیوژنیک مربوطه تولید شده است.