بررسی تولید لواستاتین ( داروی کاهش دهنده کلسترول) توسط قارچ آسپرژیلوس ترئوس

۱. مقدمه

استاتین ها متابولیت های ثانویه ای هستند که توسط برخی از گونه های قارچی تولید می شوند و به طور گسترده جهت کاهش سطح کلسترول بالا در پلاسمای خون استفاده می شوند. بنابراین یکی از موثرترین و مناسب‌ترین ترکیبات در درمان هایپرکلسترولمی و کاهش خطر ابتلا به بیماری‌های قلبی عروقی محسوب می‌شوند. استاتین ها در ابتدا در قارچ ها و مخمرها کشف شدند. در حال حاضر، استاتین‌های سنتز شده شیمیایی با مدل مولکول‌های طبیعی استاتین تولید می‌شوند. استاتین های طبیعی لواستاتین و کمپکتین هستند وکمپکتین در بین استاتین های حاصل از تخمیر، کمترین قدرت را دارد. بنابراین لواستاتین کاربرد بیشتری در صنعت پزشکی جهت کاهش سطح کلسترول بالا را دارد. لواستاتین (C24H36O5) در دهه 1970 کشف شد و اولین داروی هیپوکلسترولمی بود که توسط سازمان غذا و داروی ایالات متحده تایید شد و در توسعه بالینی به عنوان داروهای بالقوه برای کاهش کلسترول LDL استفاده شد. همچنین به عنوان یک عامل درمانی بالقوه برای درمان انواع مختلف تومورها به دلیل توانایی آن در سرکوب رشد تومور در داخل بدن از طریق مهار سنتز ترکیبات ایزوپرنوئید غیراسترولی معرفی شده است. به طور کلی لواستاتین، یک ترکیب پلی کتیدی و متابولیت ثانویه طبیعی است که معمولاً در غذاهایی مانند مخمر برنج قرمز و قارچ صدفی یافت می‌شود و برای درمان اختلالات چربی خون و پیشگیری از بیماری‌های مرتبط با قلب استفاده می‌شود. لواستاتین، همچنین به عنوان Mevinolin، Monacolin K، Mevacor نیز شناخته می شود. لواستاتین در طی متابولیسم ثانویه توسط قارچ های خاصی از جمله Aspergillus sp.، Trichoderma sp.، Monascus sp. و Penicillium sp. تولید میشود. با این حال، Aspergillus terreus معمولاً در کاربردهای صنعتی استفاده می‌شود.

آسپرژیلوس ترئوس یک آسکومیکوتا رشته ای است که منشأ مهمی برای تولید لواستاتین می باشد. قارچ های رشته ای دسته ای از میکروارگانیسم های مهم هستند که در بسیاری از زمینه ها مانند دارو، غذا و صنایع شیمیایی نقش مهمی ایفا می کنند. آسپرژیلوس ترئوس یک قارچ پراکنده در سراسر جهان با سرهای مخروطی ستونی به رنگ قهوه ای مایل به زرد تا قهوه ای تیره است. سویه ها اغلب از نمونه های مختلف محیطی مانند خاک، آب، گیاهان و غذاها جدا می شوند. آسپرژیلوس ترئوس ارزش اقتصادی مهمی در بیوتکنولوژی دارد و به عنوان یک تولید کننده صنعتی عالی اسید ایتاکونیک و لواستاتین توسعه یافته است. مورفولوژی آسپرژیلوس ترئوس یکی از موثرترین عوامل در تولید لواستاتین است و فرم pellet مناسب ترین مورفولوژی برای تولید لواستاتین است. آسپرژیلوس ترئوس هوازی است، اما محیط را با رشد خود چسبناک تر می کند، بنابراین برای حفظ هوادهی مناسب در کشت غوطه وری باید از هم زدن استفاده کرد. از طرف دیگر، این هم زدن باعث ایجاد تنش برشی در محیط می شود که باعث آسیب رساندن به مورفولوژی قارچ می شود که در نهایت منجر به کاهش تولید لواستاتین می گردد .بنابراین امروزه از بیورآکتور های جدید که کمترین آسیب و تنش برشی را به قارچ وارد میکند، استفاده می شود. مطالعه حاضر نیز با هدف بررسی روش های مختلف تولید لواستاتین توسط آسپرژیلوس ترئوس و بررسی پارامتر های موثر در افزایش بازده تولید، انجام پذیرفت.

2. تاکسونومی جنس آسپرژیلوس

جنس آسپرژیلوس در خانواده Aspergillaceae قرار دارد و تقریباً از ۳۵۰ گونه تشکیل شده است و به شش زیرجنس Aspergillus، Circumdati، Cremei، Fumigati، Nidulantes، Polypaecilum تقسیم می‌شود. بخش آسپرژیلوس Terrei متعلق به زیرجنس Circumdati، اولین‌باردر سال 1965 توصیف شد.

اکثر گونه‌های بخش Terrei، کونیدیه ‌های فیالیدیک غیرجنسی زردرنگ تا قهوه‌ای دارچینی را تولید می‌کنند درحالی‌که تعداد کمی از اعضا، مانند A. allahabadii و A. neoindicus، کونیدیوم‌های سفید تولید می‌کنند. A. terreus مهم‌ترین گونه در بخش Terrei، پراکنش جهانی دارد و در زیستگاه‌های متنوعی مانند خاک، توده‌های کمپوست، گردوغبار و مواد غذایی، به‌ویژه در محصولات گیاهی مانند ذرت ذخیره‌شده، برنج، جو و بادام‌زمینی  یافت می‌شود. اما به‌عنوان یک کپک رایج فساد طبقه‌بندی نمی‌شود.

3. ویژگی‌های مورفولوژیکی قارچ آسپرژیلوس ترئوس

قارچ آسپرژیلوس ترئوس بر روی محیط کشت کلنی‌هایی با سرهای مخروطی فشرده، ستونی (به طول ۵۰۰ میلی‌متر و قطر ۳۰ تا ۵۰ میلی‌متر) و دوطرفه تشکیل می‌دهند. همچنین در محیط کشت‌های Czapek یا Sabouraud dextrose agar، کلنی‌هایی به رنگ بژ رشد می‌کند و در برخی محیط کشت‌ها زردرنگ است. کونیدیوفورها دارای دیواره صاف هستند و کونیدیه ها کروی شکل، دارای دیواره‌های صاف، به قطر 1/5 تا 2/5 میلی‌متر و دارای رنگ زرد روشن است. برخلاف دیگرگونه‌های آسپرژیلوس، آسپرژیلوس ترئوس، کونیدیه ‌های جانبی ای به نام آلئوریوکونیدیا (aleurioconidia ) تولید می‌کند. این کونیدیه ‌های جانبی بدون رنگدانه هستند. آنها نقش بالقوه‌ای در پاتوژنز دارند. ژنوم گونه‌های آسپرژیلوس از نظر اندازه ۲۹ تا ۳۶ Mb است و محتوای GC  ژنوم آن‌ها 48% تا 53% می‌باشد و تعداد ژن‌های پیش‌بینی‌شده از ۹۱۱۳ تا ۱۳۵۵۳ متغیر است.

4. ظرفیت آسپرژیلوس ترئوس جهت سنتز محصولات طبیعی

اطلاعات ژنومی نشان می‌دهد که آسپرژیلوس ترئوس می‌تواند تعداد قابل‌توجهی متابولیت‌های ثانویه را بیش از حد انتظار تولید کند. آسپرژیلوس ترئوس دارای تقریباً ۹۳ متابولیت ثانویه پیش‌بینی‌شده است. گونه‌های آسپرژیلوس ترئوس تعداد زیادی متابولیت‌های ثانویه و مایکوتوکسین‌ها مانند سیتروویریدین، پاتولین، سیترینین، ترتونین و گلیوتوکسین را در شرایط آزمایشگاهی تولید می‌کنند، اما تولید in vivo چنین موادی در طول رشد تهاجمی تاکنون به خوبی مورد بررسی قرار نگرفته است. از مهم ترین متابولیت های ثانویه سنتز شده توسط این قارچ داروهای کاهش دهنده کلسترول مانند لواستاتین، ترئین، کوادرون، و استریکینون و سیکلوسپورین هستند. علاوه بر این، مانند سایر کپک ها، گونه های آسپرژیلوس ترئوس نقش مهمی در صنعت تخمیر بازی می کنند، زیرا متابولیت اولیه اسید ایتاکونیک را تولید می کنند که عمدتا در صنعت پلاستیک و رنگ استفاده می شود.

به‌طورکلی ظرفیت این قارچ جهت سنتز محصولات طبیعی به میزان بسیار زیادی وابسته به شرایط کشت آن است. جهت بهینه‌سازی ظرفیت سنتز آسپرژیلوس ترئوس باید شرایط کشت مناسبی برای این باکتری فراهم گردد. شرایط کشت این باکتری باید شامل منابع غذایی مناسب، دمای بهینه، فشار اکسیژن و pH مناسب باشد. همچنین استفاده از روش‌های مهندسی ژنتیکی برای بهبود عملکرد این باکتری و افزایش تولید محصولات طبیعی نیز می‌تواند مفید باشد؛ بنابراین با بهینه‌سازی شرایط کشت و استفاده از روش‌های پیشرفته، می‌توان ظرفیت آسپرژیلوس ترئوس برای سنتز محصولات طبیعی را افزایش داد.

5. روش تولید لواستاتین توسط آسپرژیلوس ترئوس

5.1. کشت مایع

امروزه در صنعت جهت تولید لواستاتین از قارچ آسپرژیلوس ترئوس در مقیاس بزرگ از روش غوطه‌وری یا کشت مایع استفاده می‌شود. در این روش معمولاً از بیورآکتورها به دلیل امكان کنترل پارامترهای مختلف به‌منظور تولید بیشتر محصول استفاده می‌شود، چرا که در آن حجم بیشتری وجود دارد و به دلیل وجود جریان در محیط به علت وجود همزن، دسترسي میكروارگانیسم به مواد غذایي افزایش میابد. همچنین ازآنجایی‌که در روش غوطه‌وری در اثر تنش برشی ناشی از هم زدن بر مورفولوژی قارچ آسیب وارد می‌شود، بنابراین امروزه از بیورآکتورهایی مانند Membrane Gradostat Bioreactor استفاده می‌کنند که کمترین آسیب را به قارچ وارد می‌کند؛ زیرا هیچ تنش محیطی یا مکانیکی در MGB وجود ندارد و همچنین بیوفیلم قارچ بر روی غشایی تثبیت شده است که شرایط مناسبی را برای رشد قارچ‌های رشته‌ای فراهم می‌کند. در این روش ابتدا سویه های قارچی به صورت پودر لیوفلیزه تهیه می شوند. سپس جهت نگهداری مجددا آن ها را در محیط کشت، کشت می دهیم. ترکیبات تشکیل دهنده محیط کشت مایع شامل ساکارز(g10)، عصاره مخمر(g5)، دی پتاسیم هیدروژن فسفات(g1)، نیترات سدیم(g3/0)، کلرید پتاسیم(g05/0)، سولفات منیزیم(g005/0)، سولفات آهن(g001/0)، سولفات روی(g001/0)، سولفات مس(g0005/0)، آگار(g15) در 1 لیتر آب می باشد. عناصر کمیاب ذکر شده در بالا جهت حل شدن کامل در محیط کشت ابتدا در 1000ml آب مقطر در برابر حرارت حل میشوند. pH را با NHCl به 6/3 می رسانیم. پس از این مراحل انکوباسیون در دمای 25 درجه سانتی گراد( دمای بهینه رشد برای این سویه) صورت میگیرد و پس از 5 روز انکوبه گذاری رشد واضح قارچ ها را بر روی پلیت مشاهده می کنیم. جهت بیوسنتز لواستاتین مرحله تخمیر صورت میگیرد. آزمایشات تخمیر در ارلن های 1 لیتری حاوی 250 میلی لیتر از محیط تخمیر انجام می شود و جهت تولید در مقیاس بالا از بیوراکتور و یا فرمانتور استفاده می شود. ( در این جا 2/5% لیکور ذرت به عنوان منبع نیتروژن و همچنین اسیدهای آمینه خاص نیز اضافه می شود). سپس همزدن و هوادهی انجام میشود. پس از کامل شدن تخمیر، استخراج و خالص سازی صورت می گیرد.

5.2. کشت جامد

در این نوع کشت از مواد زائد کشاورزی از قبیل شكر زرد، شكر زرد پالم، جو، ساگو، ضایعات کنجد، ارزن، راگي، سبوس گندم، سبوس برنج، دانه میوه و برنج دانه بلند به‌عنوان منبع تغذیه استفاده می‌شود و همچنین از سبوس جو، یونجه لوبیا، برگ خرما، دانه کتان، پوست پرتقال، کاه برنج، سویا، باگاس نیشکر و سبوس گندم به‌عنوان بستر تخمیر استفاده می‌شود .شرایط بهینه برای تولید لواستاتین توسط آسپرژیلوس ترئوس  در تخمیر حالت جامد با محیط های حاوی سبوس گندم و سبوس جو دوسر PH=7، دمای انکوباسیون 30 درجه سانتیگراد می باشد.

6. عوامل مؤثر بر افزایش راندمان تولید لواستاتین

6.1. تغذیه دومرحله‌ای (two-stage feeding strategy)

برای اولین‌بار Kargar و همکاران از استراتژی تغذیه دومرحله‌ای در روش Membrane Gradostat Bioreactor استفاده کردند. در واقع در تغذیه دومرحله‌ای نسبت C/N را از 5 به 40 تغییر دادند و این روش سبب افزایش قابل‌توجهی در تولید لواستاتین می‌شود.

6.2. کواروم سنسینگ (Quorum-Sensing)

کواروم سنسینگ یک مکانیسم تعامل درون‌گونه‌ای مشخصه باکتری‌ها و قارچ‌ها است. به‌عبارت‌دیگر به معنای تعامل سلول به سلول در جمعیت باکتری‌ها و قارچ‌هاست که با استفاده از سیگنال‌های شیمیایی با یکدیگر ارتباط برقرار می‌کنند. این تعامل سلول به سلول اجازه می‌دهد در اثر تعامل بهتر وظایفی مانند تولید متابولیت‌ها و کارایی آن‌ها را بهبود بخشد. 

باتوجه‌به مطالعات انجام شده گزارش شده است که مولکول‌های QS، مانند بوتیرولاکتون‌ها، در آسپرژیلوس ترئوس یافت شده‌اند. افزودن بوتیرولاکتون اگزوژن، در ۹۶ ساعت پس از تلقیح به کشت‌های آسپرژیلوس ترئوس، در بیورآکتورهای ۵ لیتری باعث افزایش ۱۵۰ درصدی تولید لواستاتین می‌شود.

6.3. pH

غلظت یون هیدروژن (pH) محیط، یکی از مهم‌ترین عواملی است که نه‌تنها بر رشد میکروارگانیسم‌ها تأثیر می‌گذارد، بلکه تأثیر زیادی بر فعالیت فیزیولوژیکی آنها دارد. pH مناسب جهت تولید لواستاتین 7-6/5 می باشد. بنابراین، pH اولیه محیط کشت 6.5 تنظیم می شود. با رشد قارچ، به دلیل تولید CO2 که با آب واکنش داده و H2CO3 تولید می کند، pH محیط کشت کاهش می یابد. بنابراین، pH محیط را می توان به عنوان یک شاخص در طول اجرا استفاده کرد تا مطمئن شود که به درستی پیش می رود.

6.4. منبع کربن

منابع کربن سه عملکرد مختلف را در سلول میکروبی تشکیل‌دهنده لواستاتین انجام می‌دهند. به‌عبارت‌دیگر منبع کربن جهت سنتز زیست‌توده، به‌عنوان منبع انرژی برای بیوسنتز و نگهداری سلول لازم است. از منابع کربنی مورداستفاده جهت سنتز لواستاتین می‌توان به گلیسرول و نشاسته اشاره کرد. مقادیر موردنیاز این منابع بسیار اهمیت دارد؛ زیرا افزایش مقدار نشاسته در محیط باعث افزایش ویسکوزیته محیط می‌شود که منجر به هوادهی ضعیف محیط کشت و در نتیجه تولید حداقل لواستاتین می‌شود. منابع کربنی دیگری نیز امروزه مورد استفاده قرار میگیرد. Sripalakit  و  Saraphanchotiwitthaya در تحقیق و آزمایش خود از روغن های گیاهی مانند روغن چای کلسیم، روغن کانولا، روغن نارگیل، روغن ذرت، روغن زیتون، روغن پالم، روغن لوبیا برنج، روغن گلرنگ، روغن کنجد، روغن سویا و روغن آفتابگردان استفاده کردند و از میان روغن‌های گیاهی غربال‌شده، محیط حاوی روغن نارگیل بهترین نتایج تولید را پس از 7 روز با تقریباً 11 برابر عملکرد بیشتر نسبت به کنترل بدون روغن نشان داد، در حالی که کمترین میزان تولید در روغن کنجد مشاهده شد. علت این موضوع به اسیدهای چرب هر روغن خوراکی گیاهی بر میگردد. افزودن اسید لینولئیک می‌تواند با تنظیم رونویسی ژن‌های دخیل در مسیر بیوسنتز، عملکرد تولید لواستاتین را افزایش دهد. در روغن‌های گیاهی مورد مطالعه آن ها، اسید لینولئیک و سایر اسیدهای چرب غیراشباع مانند اسید اولئیک و اسید لینولنیک اغلب در پروفایل‌های مختلف یافت می‌شوند اما استثنا روغن نارگیل است که عمدتاً حاوی اسیدهای چرب اشباع عمدتاً اسید لوریک است بنابراین این ممکن است به دلیل اسید لوریک باشد که با استفاده از مکانیسم مشابه می تواند به عنوان القا کننده بهتر از اسید لینولئیک عمل کند.

6.5. منبع نیتروژن

به نظر می رسد منابع نیتروژن یکی از موثرترین عوامل برای تولید لواستاتین میکروبی باشد. مطالعات بر روی چندین منبع نیتروژن آلی و معدنی نشان داد که عصاره مخمر بهترین منبع نیتروژن برای تولید لواستاتین توسط آسپرژیلوس ترئوس است. در برخی منابع اسید های امینه به عنوان یکی از منابع نیتروژن معرفی شده است. این منابع منفرد اسید آمینه عموماً بی فایده هستند زیرا محیط را اسیدی می کنند. علت این اسیدی شدن آزاد شدن یون های هیدروژن از سلول های قارچی در حین انتقال یون های آمونیوم به منظور حفظ الکتروخنثی بودن سلول ها است. این پدیده اغلب در قارچ های رشته ای دیده می شود.

6.6. دمای انکوباسیون

دما یکی از مهم‌ترین پارامترهای تنظیم‌کننده فعالیت میکروارگانیسم‌ها در محیط‌های طبیعی است. به‌طورکلی، دمای بهینه برای فعالیت آنزیم‌های تولید شده توسط میکروارگانیسم‌های مختلف که مسئول بیوسنتز یا تخریب ترکیبات هستند وجود دارد. این دمای مطلوب ممکن است مشابه یا متفاوت از دمای بهینه رشد میکروبی باشد. در مطالعه‌ای توسط Easa و همکاران مشاهده شد که دمای انکوباسیون ۳۰ درجه سانتی‌گراد دمای بهینه برای حداکثر تولید لواستاتین توسط آسپرژیلوس ترئوس است.

6.7. سرعت هوادهی و هم‌زدن

هم زدن (انتقال اکسیژن) یکی از پارامترهای کلیدی برای بهینه‌سازی فرایند و افزایش مقیاس تولید لواستاتین توسط قارچ‌ها است. در مطالعات انجام شده مشخص شده است که هم زدن و هوادهی با سرعت ۱۵۰ دور در دقیقه بهترین سرعت هم زدن برای تولید لواستاتین است. درصورتی‌که افزایش بیشتر (۲۰۰ دور در دقیقه) با تولید بهتر همراه نیست و بازده تولید را کاهش می‌دهد. زیرا در اثر نرخ هم زدگی بالا و تنش برشی ایجاد شده تغییرات مورفولوژیکی رخ‌داده و این تغییرات مورفولوژیکی مطمئناً با تغییرات فیزیولوژیکی مرتبط است که منجر به تولید کمتر متابولیت‌های ثانویه می‌شود.

7. کاربرد و مکانیسم عمل لواستاتین

در بزرگسالان، هایپرکلسترولمی یک بیماری متابولیک است که با عوارض قلبی عروقی و مرگ در انسان مرتبط است. لواستاتین یک داروی موثر برای کاهش کلسترول خون برای انسان و سایر حیوانات است. همچنین یک بازدارنده رقابتی انتخابی و قوی 3-هیدروکسی-3-متیل گلوتاریل کوآنزیمA (HMG-CoA) است. لواستاتین یک متابولیت ثانویه قارچی است که قبلا با نام‌های Mevinolin، Monacolin K و Mevacor شناخته می‌شد. این دارو آنزیم HMG-CoA ردوکتاز را که اولین آنزیم دخیل در تشکیل کلسترول است، را مهار می کند. لواستاتین علاوه بر کاهش کلسترول خون دارای فعالیت های ضد سرطانی، تعدیل کننده ایمنی و ضد التهابی نیز است. علاوه بر این، در جلوگیری از مشکلات استخوانی و همچنین شرایط عصبی نامطلوب نیز موثر است. کاربردهای درمانی دیگر لواستاتین شامل سرکوب آپوپتوز القایی، تکثیر سلولی و نکروز در زمینه بدخیمی های خونی، میباشد. علاوه بر این، برای درمان شرایطی مانند بیماری آلزایمر، بیماری عروق کرونر قلب، برخی مشکلات استخوانی و سطوح پایین عوامل نکروز تومور استفاده می شود.

لواستاتین دارویی با ساختاری به شکل حلقه بسته گاما - لاکتون است. مکانیسم عمل آن بدین صورت است که لواستاتین یک مهارکننده قوی ۳-هیدروکسی-۳- متیل گلوتاریل کوآنزیم A ردوکتاز (HMG CoA ردوکتاز) است که تبدیل اسید موالونیک از HMG CoA را کاتالیز می‌کند. بنابراین لواستاتین مسیر بیوسنتز کلسترول را مسدود می‌کند که به‌عنوان یک مهارکننده رقابتی برگشت‌پذیر برای HMG CoA عمل می‌کند و به HMG CoA ردوکتاز متصل می‌شود که با تولید موالونات تداخل می‌کند. لواستاتین بیشتر در داخل بدن به شکل فعال خود، اسید β-هیدروکسی، یک ساختار حلقه باز هیدرولیز می‌شود.