مقدمه:
با پیشرفت سریع علم و فناوری، فلزات سنگین و رادیو نوکلئید ها کاربرد های فراوانی در زمینه های مختلف مانند صنعت و پزشکی پیدا کردند. در نتیجه این موضوع سبب افزایش فلزات سنگین و ضایعات رادیونوکلئیدی شده است. بنابراین انسان از طرق مختلف در معرض تشعشعات یونیزان قرار می‌گیرد که میتواند موجب آسیب سلولی و حتی مرگ شود. بر همین اساس امروزه محققین به دنبال روش هایی جهت حذف فلزات سنگین و ضایعات رادیونوکلئیدی حاصل از تشعشعات یونیزان میباشند. در این میان باکتری Deinococcus radiodurans به دلیل دستکاری ژنتیکی آسان، توانایی در دسترس بودن کامل توالی ژنوم و همچنین توانایی فوق‌العاده در تحمل اثرات پرتوهای یونیزان و اشعه UV به عنوان یک راه حل جهت رفع این چالش مورد مطالعه قرار گرفته است .
به طور کلیDeinococcus از دو واژه یونانی dinos به معنای عجیب و coccus به معنای دانه یا توت وحشی و radiodurans از دو واژه لاتین radius و durare به معنای بازمانده از تشعشعات گرفته شده است. D. radiodurans یک باکتری گرم مثبت، دارای پیگمنت های قرمز، غیر اسپور زا و غیر بیماری زا می باشد. این باکتری یکی از مقاوم ترین موجوداتی است که تا به حال شناخته شده و به علت مقاومت در برابرسرمای شدید، کم آبی، اسید و تشعشعات یونیزان به عنوان یک باکتری پلی اکستروموفیل شناخته می شود. بنابراین به دلیل این توانایی ها، این باکتری در کاربردهای زیست پالایی اهمیت بسیاری پیدا کرده است. با این حال، این باکتری توانایی ذاتی برای تشکیل بیوفیلم را ندارد به همین دلیل محققین به سوی استفاده از سویه های دستکاری ژنتیکی شده این میکروارگانیسم که توانایی تولید بیوفیلم دارند، گام برداشته اند. پس از کشف این ارگانیسم فوق العاده مقاوم در برابر تشعشعات، زیست شناسان در تلاش بوده‌اند تا مکانیسم های تحمل این باکتری در برابر تشعشعات یونیزان را کشف کنند. در این مقاله، ما بر روی بررسی ها و استراتژی های اخیر در رابطه با علت مقاومت شدید این میکروارگانیسم در برابر پرتوهای یونیزان و کاربرد این باکتری در زیست پالایی تمرکز می کنیم تا به درک کاملی از این میکروارگانیسم دست یابیم.
Deinococcus radiodurans:
این باکتری توسط آرتور اندرسون در سال 1956 کشف شد. او این باکتری را از یک قوطی گوشت فاسد که با استفاده از پرتو های گاما با دوز بالا استریل شده بود، جدا کرد. D.radiodurans یک باکتری پلی اکستروموفیل می باشد که تابش یونیزه کننده، اسید، نور ماورا بنفش، سرما، خشک شدن، محیط های خلا و مواد الکتروفیل قوی و اکسید کننده را تحمل می کند بنابراین به عنوان یکی از میکروارگانیسم های مورد علاقه برای مطالعات در حوزه بیولوژی مولکولی و بیوتکنولوژی شناخته شده است. این باکتری کروی شکل با قطر 1/5 تا 3/5 میکرومتر می باشد و در اثر اتصال چهار سلول آن یک ساختار تتراد تشکیل میشود. این باکتری غیر متحرک، هوازی اجباری و کمو ارگانو تروف بر روی محیط کشت کلونی های محدب، صاف و صورتی تشکیل می دهد و معمولا در آب، لبنیات، گوشت، فاضلاب، خاک، مدفوع و محیط های پرتوزا در مراکز پژوهشی و صنعتی نیز یافت میشود.
مورفولوژی و نحوه رشد D.radiodurans:
D.radiodurans یک باکتری کروی با قطر 1/5 تا 3/5 میکرومتر است که به‌صورت تتراد دیده میشود. در واقع رشد این باکتری طی شش فاز صورت می‌گیرد و در نهایت پس تکمیل مراحل رشد به حالت تتراد درمی‌آید. در فاز 1 سلول ها در مقایسه با سایر سلول ها که بیضوی هستند، گرد میشوند. در فاز 2 سلول ها از نظر اندازه تقریبا اندازه سلول های فاز 1 هستند اما اندکی فرورفتگی در محل اتصال بین سپتوم مرکزی و محیط سلول ایجاد میشود. در فاز3 سپتوم های جدید شروع به رشد میکنند و در فاز4 رشد جزئی سپتوم در سلول رخ می دهد. در فاز5 سپتوم تازه تشکیل شده شان تقریبا بسته است. در فاز6 سلول ها چهارتایی هستند و رشد کامل صورت گرفته است.
ساختار دیواره سلولی:
دیواره سلولی D. radiodurans در بسیاری از مطالعات مورد بررسی قرار گرفته است اما ساختار دقیق دیواره سلولی آن هنوز مشخص نیست زیرا دارای دیواره ای بسیار پیچیده تر از سایر باکتریها می باشد. اگرچه این باکتری گرم مثبت است اما پوشش سلولی آن غیرعادی است و به دلیل ساختار چند لایه و ترکیب لیپیدی آن مانند دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی است و دارای outer membrane نیز می باشد. همچنین دیواره سلولی این باکتری دارای گروه عاملی کربوکسیل نیز می باشد که نقش اساسی در جذب بیولوژیکی فلزات سنگین ایفا می کند. دیواره سلولی این باکتری از پنج‌لایه اصلی تشکیل شده است:
1. به نام غشای سیتوپلاسمی داخلی (inner cytoplasmic membrane)
2. دیواره سلولی سفت‌وسخت پپتیدوگلیکان (rigid peptidoglycan cell wall)
3. لایه بینابینی(interstitial layer)
4. Hpi (for Hexagonally Packed Intermediate) و لایه پشتی غشا مانند (membrane-like backing layer)
5. پوشش کربوهیدراتی (carbohydrate coat )
این لایه ها دیواره سلولی با ضخامت ۷۰ نانومتر را تشکیل میدهند.
بخشی از دیواره سلولی که حاوی لایه بینابینی، لایه پشتی، لایه Hpi و پوشش کربوهیدراتی است، به دلیل رنگی که کاروتنوئیدها (معروف به Deinoxanthin) در لایه Hpi دارند، به‌عنوان "پوشش صورتی" نامیده میشود.این پوشش صورتی از کاروتنوئیدها، لیپیدها، پروتئین‌ها و پلی‌ساکاریدها تشکیل شده است. لایه Hpi از نظر ساختاری در یک شبکه شش‌ضلعی سازماندهی شده است. دو تا از فراوان‌ترین پروتئین‌های لایه Hpi، پروتئین‌های Hpi و پروتئین‌های SlpA (پروتئین لایه سطحی A) هستند. حذف Hpi تقریباً هیچ تأثیری نه بر ساختار پوشش صورتی و نه بر بقای سلول و پاسخ به استرس ندارد. بااین‌حال، حذف SplA منجر به تغییرات واضح در زنده‌ماندن سلول و پاسخ به استرس میشود .
ژنوم:
ژنوم D. radiodurans از دو کروموزوم، یک مگا پلاسمید و یک پلاسمید تشکیل شده است که حدودا شامل 3195 ژن است و حدود 2000 پروتئین را کد میکند . همچنین ژنوم D. radiodurans دارای محتوای GC بالایی است که به 66/6٪ می رسد. طی تحقیقات اخیرنشان داده شده است که ژنوم این میکروارگانیسم ساختار حلقه مانندی را اتخاذ می کند که تحت تأثیر دوزهای بالای تابش گاما قرار نمی گیرد.بر این اساس این میکروارگانیسم می تواند دوز 5000 Gy یا 500000 Rad تشعشعات یونیزان را تحمل کند و زنده می ماند. در مقایسه با این باکتری، انسان را می توان با دوز تشعشع به اندازه 5 Gy از بین برد.یکی از دلایل این مقاومت، قدرت و توانایی بازسازی یک ژنوم عملکردی از صدها قطعه کروموزومی ناشی از قرار گرفتن در معرض پرتوهای یونیزان یا به عبارت دیگر سیستم قوی ترمیم DNA است در حالی که ژنوم اکثر ارگانیسم ها تحت شرایط یکسان به طور برگشت ناپذیر متلاشی می شوند.درواقع پرتوهای یونیزان چندین شکست در ژنوم ایجاد می کنند. این شکستگی‌های کروموزوم‌ها طی 12 تا 24 ساعت توسط یک فرآیند دو مرحله‌ای ترمیم میشوند.
مکانیسم مقاومت D. Radiodurans به تشعشعات:
D. radiodurans از طریق دو مکانیسم ترمیم DNA (DNA repair mechanism) و مکانیسم آنتی‌اکسیدانی (Antioxidant mechanism) در برابر اثرات مضر پرتوهای یونیزان مقاومت میکند.
الف) مکانیسم ترمیم DNA
به‌طورکلی تشعشعات یونیزان سبب تولید ROS ( گونه‌های فعال اکسیژن) میشوند و رادیکال‌های آزاد را افزایش میدهد و این فرایند سبب واردشدن آسیب حاد به DNA میشود. این آسیب در میکروارگانیسم‌ها توسط سیستم ترمیم DNA اصلاح میشود. D. radiodurans دارای یک مکانیسم مؤثر ترمیم است که سبب میشود DNA آسیب‌دیده به‌درستی دوباره جمع میشود. به‌عبارت‌دیگر این مکانیسم شامل شناسایی DNA آسیب‌دیده، ترمیم و بازسازی است. این باکتری در مقایسه با باکتریهای دیگر قابلیت ترمیم فوق‌العاده‌ای دارد. ترمیم شکست دو رشته‌ای در DNA بامکانیسمی به نام extended synthesis-dependent strand annealing انجام میشود. که شامل مولکول‌های پروتئین خاصی است که این پروتئین‌ها در سیستم ترمیم DNA شرکت میکنند. این پروتئین‌ها ژن‌هایی را که برای مکانیسم ترمیم DNA ضروری هستند را تنظیم میکنند و از باکتری در برابر تشعشعات یا آسیب ناشی از خشکی محافظت میکنند.
ب) مکانیسم آنتی‌اکسیدانی
D. radiodurans دارای یک سیستم آنتی‌اکسیدانی قوی برای محافظت از خود در برابر استرس اکسیداتیو در مقایسه با سایر موجودات است. این مکانیسم آنتی‌اکسیدانی شامل دو مکانیسم آنزیمی و غیرآنزیمی است و این میکروارگانیسم از طریق این دو مکانیسم رادیونوکلئیدها را از بین می‌برد.
مکانیسم غیر آنزیمی: این مکانیسم توسط کاروتنوئید ها که در باکتری های غیر فوتوتروف، به عنوان روبنده های ROS در محافظت سلولی نقش دارند و در اکثر اکسترموفیل‌ها مشاهده میشوند و همچنین یون های +2Mn که یک عنصر مهم برای همه موجودات روی زمین جهت رشد، متابولیسم و سیستم ضد اکسیداتیو است، واسطه میشود. منگنز یک عامل مرکزی سیستم آنتی اکسیدانی در سلول ها است. شواهد متعدد نشان داده است که غلظت منگنز درون سلولی ارتباط نزدیکی با قابلیت آنتی اکسیدانی سلول ها دارد .تحقیقات نشان داده است که میکروارگانیسم مقاوم با قرار گرفتن در معرض یک محیط رادیواکتیو نسبت بالایی از یون های Fe2+ و Mn2+ دارند. این ها با مولکول های پپتید یا اسید های آمینه کمپلکس تشکیل میدهند و و رادیکال های آزاد را از بین برده و هیدروژن پراکسید را تجزیه می کنند. همچنین این باکتری یک لایه پارا کریستالی منظم از پروتئین ها به نام لایه سطحی(Surface layer) و یا S-layer دارد که سطح خارجی غشای خارجی را احاطه کرده است. لایه S خارجی ترین لایه پوشش سلولی است. این ساختار پوششی در برخی باکتری ها و آرکی ها دیده می شود و نقش اساسی در ایجاد سفتی سلول، شکل، چسبندگی و مقاومت در برابر شرایط سخت و شدید دارند. واسطه جایگزینی به نام Deinoxanthin وجود دارد که با این لایه S کمپلکس تشکیل میدهد. این کمپلکس یک همو هگزامر حدودا 770 Kda است و به عنوان مانعی در برابر خشک شدن، دمای بالا و تابش الکترومغناطیس عمل میکند. Deinoxanthin به باکتری رنگ نارنجی مایل به قرمز منحصر به فرد خود می دهد و از ماکرومولکول های سلولی شامل DNA، پروتئین و چربی در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت می کند .
مکانیسم آنزیمی: D. radiodurans دارای آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی است و مکانیسم آنزیمی مهار ROS توسط سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیداز، پروتئین‌های محافظت‌کننده DNA و کاتالاز تحریک میشود. کاتالازها، آنزیم‌های مهمی هستند که از ارگانیسم در برابر آسیب اکسیداتیو H2O2 محافظت میکنند. سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، که از طریق کاتالیز کردن تغییر مولکول رادیکال سوپر اکسید به اکسیژن مولکولی معمولی و ترکیبات کمتر سمی پراکسید هیدروژن از سلول در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت میکند، یک آنزیم حیاتی است.
نقش و کاربرد D. radiodurans در زیست پالایی:
به طور کلی عناصر رادیواکتیو و تشعشعات کاربرد گسترده ای در پزشکی، تولید انرژی هسته‌ای، سلاح‌های هسته‌ای، ضدعفونی کردن فاضلاب، صنعت غذا و تولید کودهای رادیواکتیو برای بهبود محصولات، استریل کردن تجهیزات جراحی و درمان سرطان دارند. بنابراین امروزه آلودگی فلزات سنگین، رادیونوکلئیدها و عناصر رادیواکتیو به یک مشکل جدی زیست محیطی اجتناب ناپذیر در جامعه بشری تبدیل شده است. ادغام دوز بالایی از این عناصر رادیواکتیو در بافت های موجودات زنده از طریق بلع، استنشاق یا قرار گرفتن در معرض آن خطرات بالقوه ای مانند زخم، خونریزی شدید و و حتی مرگ را به دنبال دارد و ادغام دوز پایینی از این عناصر سبب ریزش مو و حالت تهوع می شود. تحقیقات نشان می دهند که جدی ترین آلودگی فلزات سنگین کروم، جیوه، سرب و ارسنیک است که در این میان، کروم بیشترین آلودگی را دارد زیرا حدود 40 درصد از زمین های کشاورزی آلوده را تشکیل میدهد و در پسماندهای رادیواکتیو نیز به مقدار زیاد یافت می شود که به راحتی از طریق سیستم تنفسی وارد شده و یا از طریق پوست جذب میشود . کروم به راحتی می تواند در گلبول های قرمز منتشر شود و با هموگلوبین تعامل کند. در واقع کروم به دو صورت شش ظرفیتی و سه ظر فیتی وجود دارد که کروم از نوع شش ظرفیتی بسیار سمی تر و خطرناک تر می باشد و دارای خاصیت سرطان زایی است بنابراین پاکسازی آن و تبدیل آن به شکل کمتر سمی یعنی کروم سه ظرفیتی اهمیت فراوانی دارد. در بین عناصر رادیواکتیو نیز ید و اورانیوم از اهمیت بالایی برخوردار هستند. زیرا اورانیوم حلالیت بالایی دارد. درواقع شکل رادیو اکتیویته اورانیوم نیترات اورانیل است که یون اورانیل شکل بسیار محلول اورانیوم رادیواکتیو میباشد و می تواند در آب های زیر زمینی و خاک به راحتی حل میشود و منجر به اثرات مضر بر سلامت انسان شود . بنابراین حذف آن بسیار مهم است. ید نیز به عنوان یکی از خطرناک ترین عناصر در حوادث نیروگاه هسته ای در نظر گرفته میشود. زیرا میتواند در غده تیروئید جمع شود و باعث سرطان تیروئید شود و حتی ممکن است سبب ایجاد جهش های ژنتیکی شود. بر همین اساس حذف این آلودگی ها از چالش های مهم تلقی می شود و یکی از بهترین و کاربردی ترین روش ها جهت حذف این آلودگی ها زیست پالایی (Bioremediation) می باشد. زیست پالایی به فرآیندی اطلاق می شود که در آن جهت حذف آلاینده ها از محیط آلوده از میکروارگانیسم ها، قارچ ها، گیاهان یا آنزیم ها استفاده می شود. تکنولوژی های پاکسازی موجود گران و خطرناک هستند و روش زیست پالایی با کمک میکروارگانیسم ها یک روش جایگزین بسیار مناسب است. از مزایای روش زیست پالایی می توان به پایدار و بی ضرر بودن محصول نهایی، عدم آسیب رسانی به موادمغذی موجود درخاک و حذف کامل آلاینده های موجود در محیط اشاره کرد. میکروارگانیسم هایی که در روش زیست پالایی استفاده می شوند، باید بتوانند در برابر سمیت سلولی ناشی از فلزات سنگین و تشعشعات یونیزان مقاومت کنند و بتواند زباله های رادیواکتیو و فلزات سمی را حذف کنند و D. radiodurans به عنوان مقاوم ترین موجودات شناخته شده در برابر تشعشعات شناخته شده است. امروزه روش های مهندسی ژنتیک به طور گسترده برای افزایش پتانسیل زیست پالایی D. radiodurans استفاده میشود. به عنوان مثال انتقال ژن PhoN از سالمونلا تیفی موریوم به D. radiodurans سبب میشود این باکتری نوترکیب دارای نرخ 85/64 % برای حذف اورانیوم باشد که دوبرابر بیشتر از نوع WILD آن می باشد. همچنین انتقال ژن PhoK از اسفنگوموناس به D. radiodurans سبب می شود سویه نوترکیب فعالیت الکالاین فسفاتاز بسیار بالایی نشان دهد و به طور موثر اورانیوم را در محدوده وسیعی از غلظت رسوب میدهد. امروزه باتوجه‌به افزایش توانمندی‌های علمی از میکروارگانیسم‌های مقاوم به تشعشعات مانند D. radiodurans برای ساخت حسگرهای زیستی یا بیو سنسورها جهت اندازه‌گیری رادیواکتیویته در یک محیط بسیار پرتوزا استفاده میشود و این بیو سنسورها می‌توانند داده‌هایی را در مورد مکان‌های آلوده ارائه دهند. این بیو سنسورها سریع، مقرون به صرفه و کارآمد میباشند.
