استخراج DNA از قارچ

مقدمه:

سلول های قارچی حاوی ژنوم (DNA) در هسته ای مجزا هستند. آنها همچنین حاوی DNA خارج کروموزومی در میتوکندری هستند. معمولاً به دلیل دیواره سلولی قارچی، جداسازی DNA از قارچ‌ها دشوارتر از باکتری‌ها یا سلول‌های پستانداران است و نیاز به مراحل اضافی شامل استفاده از روش‌های آنزیمی، مکانیکی یا شیمیایی برای تجزیه دیواره سلولی قارچی دارد. زیرا قارچ ها دارای یک دیواره سلولی سفت، چند لایه و پیچیده هستند که از ساختارهای سلولی آن محافظت میکند و استحکام می بخشد. به طور کلی هدف از استخراج DNA از قارچ ها  تشخیص و شناسایی پاتوژن های قارچی و مطالعه علل ژنتیکی بیماری ها و تشخیص داروها می باشد. چندین پروتکل جهت استخراج DNA در دسترس است اما هیچ پروتکل واحدی وجود ندارد.

انواع متود ها و روش های استخراج DNA از قارچ:

1. QS ( quick and safe method)

2. Standard CTAB method

3. SDS method

4. Combined CTAB and SDS method

5. Urea/Chelex/SDS method

6. Glass beads method

7. Lysis buffer method

8. Microwave method

9. Sonification method

10. Enzymatic lysis method

11. Universal method

12. Rapid and a direct method

چهار مرحله اصلی استخراج DNA:

قبل از انجام مراحل اصلی ابتدا لازم است برداشت بافت قارچی صورت گیرد (Harvesting of fungal tissue):

یک لوله میکرو سانتریفیوژ خالی 1/5 میلی لیتری برداشته و سپس با استفاده از یک scalpel  میسلیوم را خراش میدهیم (10 میلی گرم) و آن را در لوله میکروسانتریفیوژ قرار میدهیم و در نهایت در دمای 20- سانتی گراد آن را ذخیره و نگهداری میکنیم. برخی اوقات نمونه آماده شده را در معرض خشک کردن انجمادی قرار میدهند.

خشک کردن انجمادی نمونه های قارچی (Freeze-drying of fungal samples):

فرآیند خشک کردن انجمادی، حذف یخ یا سایر حلال های منجمد از یک ماده از طریق فرآیند تصعید است.

شامل سه مرحله انجماد، خلاء و سپس خشک کردن است. خشک کردن انجمادی قطعه قطعه شدن DNA را کاهش می دهد و مقدار DNA را افزایش می دهد. روش انجام این مرحله به شرح زیر می باشد:

1) بافت را کاملا منجمد کنید:

این امر یا با استفاده از نیتروژن مایع یا با ذخیره سازی در دمای 20- درجه سانتی گراد به مدت 2 تا 3 ساعت به دست می آید.

2) لوله ها با پارافیلم مهر و موم شده و 3 تا 5 سوراخ کوچک در درب با استفاده از سوزن ایجاد کنید:

پارافیلم تضمین می کند که درب ها در طول فرآیند خشک کردن انجمادی باز نشوند.

3) نمونه ها را در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری کنید.

4) نمونه ها را در freeze-dryer قرار دهید:

خلاء را روی 018/ 0میلی بار و دما 58 درجه سانتیگراد تنظیم کنید.

5) نمونه ها را می توان در یک ظرف در بسته در دمای 18 تا 27 درجه سانتیگراد تا 1 سال نگهداری کرد.

در ادامه به بررسی برخی از روش های مهم میپردازیم.

روش اول- a quick and safe ( QS ) DNA extraction method :

این روش QS نه تنها برای طیف وسیعی از یوکاریوت های میکروبی، از جمله قارچ های واقعی و اومیست ها (oomycetes )، بلکه برای گلسنگ ها و گیاهان نیز قابل استفاده است.

1) کشت میسلیوم

• تلقیح سویه های قارچی در محیط آگار.

• انکوباسیون پلیت ها.

2) آماده سازی لوله های واکنش در لوله های 1/5 میلی لیتری

3) افزودن 0/5 میلی لیتر بافر استخراج و 0/3 میلی لیتر 2 – پروپانول

4) برداشت بافت های قارچی

• برداشت 10تا20 میلی گرم توده قارچی (20تا40 میلی متر بافت میسلیوم) با استفاده از خلال دندان از کلنی در حال رشد و قرار دادن آن در بافر استخراج.

5) پودر کردن بافت های قارچی به صورت مکانیکی

• در هر نمونه توده قارچی را با آسیاب برقی پودر کنید.

• پودر کردن کامل مورد نیاز نیست.

6) حذف بقایای سلولی (cell debris) و آلاینده ها (contaminants)

•  از طریق سانتریفیوژ ( 5000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه ).

•  افزودن مایع رویی (supernatant) به لوله های 2-پروپانول که در مرحله 2 تهیه شده است.

7) ترسیب DNA

• مایع رویی و 2-پروپانول  را با چند بار معکوس کردن لوله مخلوط کنید.

• لوله را در 12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کنید.

8) حل کردن رسوب DNA

• تبخیر باقیمانده EtOH با انکوباسیون در دمای 0 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه.

• افزودن آب مقطر یا IX TE و هم زدن با سرعت کم جهت حل کردن رسوب.

روش دوم- CTAB :

روش استخراج CTAB در ابتدا در سال 1987 برای استخراج بافت گیاهی توسعه یافت. این روش برای حذف کربوهیدرات‌ها در نظر گرفته شد، اما زمان‌بر و فشرده است و منجر به تولید DNA رضایت‌بخش از تمام نمونه‌های بیولوژیکی از جمله میسلیوم‌های قارچی و هاگ نمی‌شود. انواع روش های اصلاح شده CTAB در حال حاضر برای استخراج و خالص سازی DNA قارچ با استفاده از حلال های آلی موجود است.

مزایا و معایب این روش:

مزیت: روش استخراج CTAB برای کاربردهای وسیع، مؤثر و قابل استفاده است.

معایب: در این پروتکل از حلال‌های آلی استفاده می‌شود و ماهیت مضر برخی از حلال‌ها، همراه با زمان نسبتاً طولانی تکمیل پروتکل، می‌تواند استفاده از این روش را محدود کند.

مراحل این روش به شرح زیر می باشد:

1) دیواره سلولی میسلیوم قارچی از طریق آسیاب کردن با میله های شیشه ای یا هاون در حضور نیتروژن مایع شکسته می شود.

2) سپس بافر استخراج CTAB اضافه می شود.

3) انکوباسیون در دمای 65 درجه سانتی گراد صورت میگیرد.

4) خالص سازی با فنل: کلروفرم: ایزوآمیل الکل (25:24:1).

5) ترسیب DNA با ایزوپروپانول.

6) در نهایت، DNA در 50 میکرولیتر آب خالص یا بافر TE حل می شود.

روش سوم- SDS method :

1) آماده سازی میسلیوم قارچی.

2) استفاده از بافر استخراج 0/2 میلی لیتر.

3) افزودن 0/2 میلی لیتر مخلوط کلروفرم فنول .

4) انکوباسیون در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه.

5) خنک کردن مخلوط تا دمای اتاق و سپس سانتریفیوژ کردن در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ.

6) انتقال مایع رویی (supernatant) به یک لوله.

7) افزودن حجم مساوی ایزوپروپانول سرد یا اتانول و سپس مخلوط کردن محتویات به طور کامل تا DNA در دمای 20- درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه رسوب کند.

روش چهارم- Combined CTAB and SDS method :

این روش بهتر و سریعتر از روش CTAB و SDS برای جداسازی DNA ژنومی از پاتوژن های قارچی ناشی از غذا است. مراحل این روش به شرح زیر می باشد:

1) آماده سازی 200 میلی گرم پودر میسلیوم لیوفیلیزه.

2) افزودن بافر استخراج 500 میکرولیتری .

3) میکس کردن و همزدن و سپس به مدت 10 دقیقه در 50 درجه سانتیگراد بجوشانید.

4) سانتریفیوژ در 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه.

5) مایع رویی فوقانی را جدا کرده و با کلروفرم: ایزوآمیل الکل (23:2) مخلوط کنید.

6) سانتریفیوژ 10000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه.

7) بازیابی کردن فاز آبی.

8) مخلوط کردن با یک حجم ایزوپروپانول جهت ترسیب DNA.

رعایت نکات ایمنی مهم در هنگام استخراج DNA:

1) تمام اقدامات احتیاطی باید برای جلوگیری از آلودگی ناشی از آزمایشگاه در طول استخراج DNA انجام شود.

2) جهت جلوگیری از آلودگی سوزن و آنس باید استریل شود.

3) بطری ها و لوله های کشت را می توان با محلول دی اتیل پیروکربنات 0/1% در دمای 37 درجه سانتیگراد در طول شب، دو بار در 121 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه اتوکلاو کرد و سپس قبل از استفاده در دمای  100 درجه سانتیگراد خشک کرد.

4) پیپت ها و صفحات پتری قبل از کار باید با بخار استریل شوند.

5) استفاده از دستکش و عینک ایمنی ضروری است زیرا اکثر پروتکل ها شامل مواد شیمیایی خطرناک می باشند.

بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده از قارچ:

جهت بررسی کمیت DNA استخراج شده غلظت نمونه های DNA (ng/μl) با طول موج 260 نانومتر توسز اسپکتروفتومتری اندازه گیری میشود همچنین جهت بررسی کیفیت DNA استخراج شده از اسپکتروفتومتر UV-VIS یا NanoDrop استفاده میشود و با به دست آوردن غلظت های DNA در دو طول موج 260/280 خلوص  ارزیابی می شود. حاصل این نسبت در DNA با کیفیت خوب، 1/7 تا 2/0 خواهد بود.